Plazmid
.svg)
Bir plazmid, bir hücre içinde kromozomal DNA'dan fiziksel olarak ayrılan ve bağımsız olarak çoğalabilen küçük, ekstrakromozomal bir DNA molekülüdür. En yaygın olarak bakterilerde küçük dairesel, çift sarmallı DNA molekülleri olarak bulunurlar; ancak plazmidler bazen arkea ve ökaryotik organizmalarda da mevcuttur. Doğada plazmidler genellikle organizmanın hayatta kalmasına fayda sağlayan ve antibiyotik direnci gibi seçici avantaj sağlayan genler taşır. Kromozomlar büyüktür ve normal koşullar altında yaşamak için gerekli tüm genetik bilgileri içerirken, plazmidler genellikle çok küçüktür ve yalnızca belirli durumlarda veya koşullarda yararlı olabilecek ek genler içerir. Yapay plazmidler, moleküler klonlamada vektör olarak yaygın şekilde kullanılır ve konak organizmalarda rekombinant DNA dizilerinin çoğaltılmasına hizmet eder. Laboratuvarda, plazmidler transformasyon yoluyla bir hücreye sokulabilir. Sentetik plazmidler internet üzerinden temin edilebilir. ⓘ
Plazmidler, uygun bir konakçı içinde bağımsız olarak çoğalabilen DNA birimleri olan replikonlar olarak kabul edilir. Bununla birlikte, plazmidler, virüsler gibi, genellikle yaşam olarak sınıflandırılmazlar. Plazmidler bir bakteriden diğerine (hatta başka bir türe) çoğunlukla konjugasyon yoluyla aktarılır. Genetik materyalin bu konaktan konağa aktarımı, yatay gen aktarımının bir mekanizmasıdır ve plazmidler mobilomun bir parçası olarak kabul edilir. Genetik materyallerini kapsid adı verilen koruyucu bir protein kılıfı içine alan virüslerin aksine, plazmidler "çıplak" DNA'dır ve yeni bir konağa transfer için genetik materyali kaplamak üzere gerekli genleri kodlamazlar; ancak bazı plazmid sınıfları kendi transferleri için gerekli olan konjugatif "seks" pilusunu kodlar. Plazmidlerin boyutları 1 ila 400 kbp arasında değişir ve tek bir hücredeki özdeş plazmidlerin sayısı bazı durumlarda bir ila binlerce arasında değişebilir. ⓘ
.svg)
Plazmid, kendi kendini eşleyebilen, kromozomdan ayrı bir DNA parçasıdır. Tipik olarak dairesel ve çift sarmallıdır. Genelde bakterilerde, bazen ökaryotlarda da (örneğin Saccharomyces cerevisiae deki 2 mikrometre plazmidi ) bulunur. Plazmidlerin boyu 1 ila 400 kilobaz çifti arasında değişir. Bir hücrede büyük bir plasmidin bir kopyası, daha küçük boy plazmidlerin ise yüzlerce kopyası bulunabilir. Hatta, yüksek kopya sayısına sahip olması amacıyla seleksiyona uğratılmış bazı yapay plazmidlerin (örneğin pUC plazmid serisindekilerin) binlerce kopyası olabilir. ⓘ
Plazmid terimi Amerikalı moleküler biyolog Joshua Lederberg tarafından 1952'de ilk defa kullanılmıştır. ⓘ
Tarihçe
Plazmid terimi 1952 yılında Amerikalı moleküler biyolog Joshua Lederberg tarafından "herhangi bir ekstrakromozomal kalıtsal belirleyiciyi" ifade etmek üzere ortaya atılmıştır. Terimin ilk kullanımı, replikasyon döngüsünün en azından bir kısmı için ekstrakromozomal olarak var olan herhangi bir bakteriyel genetik materyali içeriyordu, ancak bu tanım bakteriyel virüsleri de içerdiğinden, plazmid kavramı zamanla otonom olarak çoğalan genetik elementleri içerecek şekilde geliştirildi. Daha sonra 1968'de plazmid teriminin ekstrakromozomal genetik element terimi olarak kabul edilmesine karar verilmiş ve virüslerden ayırt etmek için tanım, yalnızca veya ağırlıklı olarak kromozom dışında bulunan ve otonom olarak çoğalabilen genetik elementlerle daraltılmıştır. ⓘ
Özellikleri ve karakteristikleri
.svg)
Plazmidlerin bir hücre içinde bağımsız olarak çoğalabilmeleri için, çoğalma orijini olarak hareket edebilecek bir DNA parçasına sahip olmaları gerekir. Kendi kendini kopyalayan birim, bu durumda plazmid, replikon olarak adlandırılır. Tipik bir bakteriyel replikon, plazmide özgü replikasyon başlatma proteini (Rep) geni, iteron adı verilen tekrar eden birimler, DnaA kutuları ve bitişik bir AT açısından zengin bölge gibi bir dizi unsurdan oluşabilir. Daha küçük plazmidler kendi kopyalarını oluşturmak için konakçı replikatif enzimlerinden yararlanırken, daha büyük plazmidler bu plazmidlerin replikasyonu için spesifik genler taşıyabilir. Birkaç plazmid türü de konakçı kromozomuna eklenebilir ve bu bütünleştirici plazmidler bazen prokaryotlarda epizom olarak adlandırılır. ⓘ
Plazmidler neredeyse her zaman en az bir gen taşır. Bir plazmid tarafından taşınan genlerin çoğu konak hücre için faydalıdır, örneğin: konak hücrenin aksi takdirde öldürücü veya büyümeyi kısıtlayıcı olacak bir ortamda hayatta kalmasını sağlar. Bu genlerden bazıları antibiyotik direnci veya ağır metallere karşı direnç özelliklerini kodlarken, diğerleri bir bakterinin bir konakçıda kolonileşmesini ve savunmasının üstesinden gelmesini sağlayan virülans faktörleri üretebilir veya bakterinin inatçı veya toksik organik bileşikleri bozma yeteneği de dahil olmak üzere belirli bir besin maddesini kullanmasına izin veren spesifik metabolik işlevlere sahip olabilir. Plazmidler ayrıca bakterilere nitrojen sabitleme yeteneği de sağlayabilir. Ancak bazı plazmidlerin konak hücrenin fenotipi üzerinde gözlemlenebilir bir etkisi yoktur veya konak hücrelere faydası belirlenemez ve bu plazmidlere kriptik plazmidler denir. ⓘ
Doğal olarak oluşan plazmidler fiziksel özellikleri bakımından büyük farklılıklar gösterir. Boyutları 1 kilobaz çiftinden (kbp) daha az olan çok küçük mini plazmidlerden birkaç megabaz çiftinden (Mbp) oluşan çok büyük megaplazmidlere kadar değişebilir. Üst uçta, bir megaplazmid ile bir minikromozom arasında çok az fark vardır. Plazmidler genellikle daireseldir, ancak doğrusal plazmid örnekleri de bilinmektedir. Bu doğrusal plazmidler, uçlarını çoğaltmak için özel mekanizmalar gerektirir. ⓘ
Plazmidler tek bir hücrede bir ila birkaç yüz arasında değişen sayılarda bulunabilir. Tek bir hücrede bulunabilecek normal plazmid kopya sayısı plazmid kopya sayısı olarak adlandırılır ve replikasyon başlangıcının nasıl düzenlendiğine ve molekülün boyutuna göre belirlenir. Daha büyük plazmidler daha düşük kopya sayısına sahip olma eğilimindedir. Her bakteride yalnızca bir veya birkaç kopya olarak bulunan düşük kopya sayılı plazmidler, hücre bölünmesi sırasında, ayrışan bakterilerden birinde kaybolma tehlikesiyle karşı karşıyadır. Bu tür tek kopya plazmidler, bir kopyayı her iki yavru hücreye aktif olarak dağıtmaya çalışan sistemlere sahiptir. ParABS sistemi ve parMRC sistemini içeren bu sistemler genellikle bir plazmidin bölme sistemi veya bölme işlevi olarak adlandırılır. ⓘ
Sınıflandırmalar ve tipler
Plazmidler çeşitli şekillerde sınıflandırılabilir. Plazmidler genel olarak konjugatif plazmidler ve konjugatif olmayan plazmidler olarak sınıflandırılabilir. Konjugatif plazmidler, farklı hücreler arasında cinsel konjugasyonu teşvik eden bir dizi transfer geni içerir. Karmaşık konjugasyon sürecinde plazmidler, bazı transfer genleri tarafından kodlanan seks pili aracılığıyla bir bakteriden diğerine aktarılabilir (şekle bakınız). Konjugatif olmayan plazmidler konjugasyonu başlatamazlar, bu nedenle sadece konjugatif plazmidlerin yardımıyla transfer edilebilirler. Bir ara sınıf plazmidler mobilize edilebilir ve transfer için gerekli genlerin yalnızca bir alt kümesini taşır. Konjugatif bir plazmidi parazitleyebilirler ve sadece onun varlığında yüksek frekansta aktarım yapabilirler. ⓘ
Plazmidler ayrıca uyumsuzluk grupları olarak da sınıflandırılabilir. Bir mikrop farklı plazmid türlerini barındırabilir, ancak farklı plazmidler tek bir bakteri hücresinde ancak uyumlu oldukları takdirde var olabilirler. Eğer iki plazmid uyumlu değilse, biri ya da diğeri hızla hücreden kaybolacaktır. Bu nedenle farklı plazmidler, birlikte var olup olamayacaklarına bağlı olarak farklı uyumsuzluk gruplarına atanabilir. Uyumsuz plazmidler (aynı uyumsuzluk grubuna ait olanlar) normalde aynı replikasyon veya bölünme mekanizmalarını paylaşırlar ve bu nedenle tek bir hücrede bir arada tutulamazlar. ⓘ
Plazmidleri sınıflandırmanın bir başka yolu da işlevleridir. Beş ana sınıf bulunmaktadır:
- Tra genleri içeren doğurganlık F-plazmidleri. Konjugasyon yeteneğine sahiptirler ve seks pili ifadesiyle sonuçlanırlar.
- Antibiyotiklere veya zehirlere karşı direnç sağlayan genler içeren direnç (R) plazmidleri. Plazmidlerin doğası anlaşılmadan önce tarihsel olarak R-faktörleri olarak bilinirdi.
- Diğer bakterileri öldürebilen proteinler olan bakteriyosinleri kodlayan genler içeren Col plazmidleri.
- Toluen ve salisilik asit gibi alışılmadık maddelerin sindirilmesini sağlayan parçalayıcı plazmidler.
- Virülans plazmidleri, bakteriyi bir patojene dönüştürür. örneğin Agrobacterium tumefaciens'deki Ti plazmidi ⓘ
Plazmidler bu fonksiyonel gruplardan birden fazlasına ait olabilir. ⓘ
RNA plazmidleri
Plazmidlerin çoğu çift sarmallı DNA molekülleri olmasına rağmen, bazıları tek sarmallı DNA veya ağırlıklı olarak çift sarmallı RNA'dan oluşur. RNA plazmidleri, mantarlarda ve alglerden kara bitkilerine kadar çeşitli bitkilerde bulunan, hem kapsüllenmiş hem de kapsüllenmemiş, enfeksiyöz olmayan ekstrakromozomal doğrusal RNA replikonlarıdır. Ancak birçok durumda, RNA plazmidlerini RNA virüslerinden ve diğer bulaşıcı RNA'lardan net bir şekilde ayırt etmek zor veya imkansız olabilir. ⓘ
Vektörler
Yapay olarak oluşturulmuş plazmidler genetik mühendisliğinde vektör olarak kullanılabilir. Bu plazmidler genetik ve biyoteknoloji laboratuvarlarında önemli araçlar olarak hizmet verirler ve genellikle belirli genleri klonlamak ve çoğaltmak (birçok kopyasını yapmak) veya ifade etmek için kullanılırlar. Bu tür kullanımlar için ticari olarak çok çeşitli plazmidler mevcuttur. Çoğaltılacak gen normalde, tipik olarak kullanımları için bir dizi özellik içeren bir plazmid içine yerleştirilir. Bunlar arasında belirli antibiyotiklere direnç sağlayan bir gen (bakteri suşları için en sık ampisilin kullanılır), bakteri hücrelerinin plazmid DNA'sını çoğaltmasına izin veren bir çoğaltma orijini ve klonlama için uygun bir bölge (çoklu klonlama bölgesi olarak adlandırılır) bulunur. ⓘ
DNA yapısal istikrarsızlığı, genetik materyalin öngörülemeyen bir şekilde yeniden düzenlenmesi, kaybı veya kazanımı ile sonuçlanan bir dizi spontane olay olarak tanımlanabilir. Bu tür olaylar sıklıkla hareketli elementlerin transpozisyonu veya kanonik olmayan (non-B) yapılar gibi kararsız elementlerin varlığı ile tetiklenir. Bakteriyel omurgaya ait aksesuar bölgeler çok çeşitli yapısal istikrarsızlık olaylarına katılabilir. Genetik istikrarsızlığın iyi bilinen katalizörleri arasında, ticari olarak temin edilebilen çok sayıda klonlama ve ifade vektöründe göze çarpan doğrudan, ters çevrilmiş ve tandem tekrarlar yer alır. Ekleme dizileri ayrıca, komşu gen ifadesinin silinmesine ve yeniden düzenlenmesine, aktivasyonuna, aşağı regülasyonuna veya inaktivasyonuna yol açarak plazmid işlevini ve verimini ciddi şekilde etkileyebilir. Bu nedenle, yabancı kodlamayan omurga dizilerinin azaltılması veya tamamen ortadan kaldırılması, bu tür olayların gerçekleşme eğilimini ve sonuç olarak plazmidin genel rekombinojenik potansiyelini belirgin bir şekilde azaltacaktır. ⓘ
Klonlama
Plazmidler en yaygın olarak kullanılan bakteriyel klonlama vektörleridir. Bu klonlama vektörleri, DNA parçalarının eklenmesine izin veren bir bölge, örneğin DNA parçalarının bağlanabileceği yaygın olarak kullanılan birkaç kısıtlama bölgesine sahip bir çoklu klonlama bölgesi veya polilinker içerir. İlgilenilen gen yerleştirildikten sonra, plazmidler transformasyon adı verilen bir işlemle bakterilere verilir. Bu plazmidler, bakterilere belirli antibiyotikleri içeren seçici bir büyüme ortamında hayatta kalma ve çoğalma yeteneği kazandıran seçilebilir bir işaretleyici, genellikle bir antibiyotik direnç geni içerir. Transformasyondan sonra hücreler seçici ortama maruz bırakılır ve sadece plazmid içeren hücreler hayatta kalabilir. Bu şekilde, antibiyotikler sadece plazmid DNA'sını içeren bakterileri seçmek için bir filtre görevi görür. Vektör ayrıca klonlanmış eklere sahip plazmidlerin seçimini kolaylaştırmak için başka işaretleyici genler veya raportör genler içerebilir. Plazmid içeren bakteriler daha sonra büyük miktarlarda yetiştirilebilir, hasat edilebilir ve ilgilenilen plazmid daha sonra çeşitli plazmid hazırlama yöntemleri kullanılarak izole edilebilir. ⓘ
Bir plazmid klonlama vektörü tipik olarak 15 kbp'ye kadar DNA parçalarını klonlamak için kullanılır. Daha uzun DNA uzunluklarını klonlamak için, lizojen genleri silinmiş lambda fajı, kozmidler, bakteriyel yapay kromozomlar veya maya yapay kromozomları kullanılır. ⓘ
Protein üretimi
Plazmidlerin bir diğer önemli kullanımı da büyük miktarlarda protein yapmaktır. Bu durumda araştırmacılar, ilgilenilen geni barındıran bir plazmid içeren bakteriler yetiştirir. Tıpkı bakterinin antibiyotik direncini sağlamak için protein üretmesi gibi, yerleştirilen genden büyük miktarlarda protein üretmesi de sağlanabilir. Bu, genin kodladığı proteini, örneğin insülini kitlesel olarak üretmenin ucuz ve kolay bir yoludur. ⓘ
Gen terapisi
Plazmidler gen terapisinde potansiyel bir tedavi olarak gen transferi için de kullanılabilir, böylece hücrelerde eksik olan proteini ifade edebilir. Gen tedavisinin bazı biçimleri, insan genomu içinde önceden seçilmiş kromozomal hedef bölgelere terapötik genlerin yerleştirilmesini gerektirir. Plazmid vektörler bu amaçla kullanılabilecek birçok yaklaşımdan biridir. Çinko parmak nükleazlar (ZFN'ler), DNA genomunda bölgeye özgü çift iplikçik kırılmasına ve homolog rekombinasyona neden olmak için bir yol sunar. ZFN kodlayan plazmidler, terapötik bir genin belirli bir bölgeye iletilmesine yardımcı olabilir, böylece hücre hasarı, kansere neden olan mutasyonlar veya bir bağışıklık tepkisi önlenir. ⓘ
Hastalık modelleri
Plazmidler tarihsel olarak sıçan genetik hastalık modelleri oluşturmak için sıçanların embriyonik kök hücrelerinin genetik mühendisliğinde kullanılmıştır. Plazmid tabanlı tekniklerin sınırlı verimliliği, daha doğru insan hücre modellerinin oluşturulmasında kullanılmalarını engellemiştir. Bununla birlikte, adeno-ilişkili virüs rekombinasyon tekniklerindeki ve çinko parmak nükleazlarındaki gelişmeler, yeni nesil izojenik insan hastalığı modellerinin oluşturulmasını sağlamıştır. ⓘ
Epizomlar
Epizom terimi 1958 yılında François Jacob ve Élie Wollman tarafından otonom olarak replike olabilen veya kromozoma entegre olabilen ekstra-kromozomal genetik materyali ifade etmek üzere ortaya atılmıştır. Ancak terimin ortaya atılmasından bu yana kullanımı değişmiş, plazmid otonom olarak replike olan ekstrakromozomal DNA için tercih edilen terim haline gelmiştir. 1968 yılında Londra'da düzenlenen bir sempozyumda bazı katılımcılar epizom teriminin terk edilmesini önermiş, ancak diğerleri terimi anlam değişikliğine uğratarak kullanmaya devam etmiştir. ⓘ
Günümüzde bazı yazarlar epizomu prokaryotlar bağlamında kromozoma entegre olabilen bir plazmidi ifade etmek için kullanmaktadır. Entegratif plazmidler çoğaltılabilir ve birden fazla nesil boyunca bir hücrede istikrarlı bir şekilde muhafaza edilebilir, ancak bir aşamada bağımsız bir plazmid molekülü olarak var olacaktır. Ökaryotlar bağlamında epizom terimi, çekirdekte çoğaltılabilen entegre olmayan ekstrakromozomal kapalı dairesel DNA molekülü anlamında kullanılır. Herpesvirüsler, adenovirüsler ve poliomavirüsler gibi virüsler bunun en yaygın örnekleridir, ancak bazıları plazmidlerdir. Diğer örnekler arasında yapay gen amplifikasyonları sırasında veya patolojik süreçlerde (örneğin kanser hücresi dönüşümü) ortaya çıkabilen çift dakika kromozomları gibi anormal kromozomal parçalar yer alır. Ökaryotlardaki epizomlar prokaryotlardaki plazmidlere benzer şekilde davranır, çünkü DNA konak hücre ile sabit bir şekilde muhafaza edilir ve çoğaltılır. Sitoplazmik viral epizomlar (poxvirus enfeksiyonlarında olduğu gibi) da oluşabilir. Herpesvirüsler gibi bazı epizomlar, bakteriyofajlara (bakteriyel faj virüsleri) benzer şekilde yuvarlanan bir daire mekanizmasıyla çoğalır. Diğerleri ise çift yönlü bir replikasyon mekanizmasıyla çoğalır (Theta tipi plazmidler). Her iki durumda da epizomlar konak hücre kromozomlarından fiziksel olarak ayrı kalır. Epstein-Barr virüsü ve Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirüs dahil olmak üzere birçok kanser virüsü, virüslerin kanser hücresi çoğalmasını teşvik eden onkogenleri ifade ettiği kanser hücrelerinde latent, kromozomal olarak farklı epizomlar olarak muhafaza edilir. Kanserlerde bu epizomlar, hücre bölündüğünde konak kromozomlarıyla birlikte pasif olarak çoğalır. Bu viral epizomlar birden fazla virüs partikülü oluşturmak için litik replikasyonu başlattığında, genellikle konak hücreyi öldüren hücresel doğal bağışıklık savunma mekanizmalarını aktive ederler. ⓘ
Plazmid bakımı
Bazı plazmidler veya mikrobiyal konakçılar, Escherichia coli'deki plazmid R1'in hok/sok (konakçı öldürme/öldürme baskılayıcı) sistemi gibi bir bağımlılık sistemi veya postsegregasyonel öldürme sistemi (PSK) içerir. Bu varyant hem uzun ömürlü bir zehir hem de kısa ömürlü bir antidot üretir. Literatürde çeşitli plazmid bağımlılık sistemleri (toksin/antitoksin, metabolizma tabanlı, ORT sistemleri) tanımlanmış ve biyoteknik (fermantasyon) veya biyomedikal (aşı tedavisi) uygulamalarda kullanılmıştır. Plazmidin bir kopyasını muhafaza eden yavru hücreler hayatta kalırken, plazmidi miras alamayan bir yavru hücre ölür ya da ana hücreden kalan zehir nedeniyle büyüme hızı azalır. Son olarak, genel üretkenlik artırılabilir. ⓘ
Buna karşılık, pUC18, pBR322 ve türetilmiş vektörler gibi biyoteknolojide kullanılan plazmidler neredeyse hiç toksin-antitoksin bağımlılık sistemleri içermez ve bu nedenle plazmid kaybını önlemek için antibiyotik baskısı altında tutulmaları gerekir. ⓘ
Maya plazmidleri
Mayalar doğal olarak çeşitli plazmidler barındırır. Bunlar arasında, genellikle mayanın genetik mühendisliği için kullanılan küçük dairesel plazmidler olan 2 μm plazmidler ve öldürücü fenotiplerden sorumlu olan Kluyveromyces lactis'ten doğrusal pGKL plazmidleri dikkat çekicidir. ⓘ
Diğer plazmid türleri genellikle aşağıdakileri içeren maya klonlama vektörleriyle ilgilidir:
- Maya bütünleştirici plazmid (YIp), hayatta kalmak ve replikasyon için konak kromozomuna entegrasyona dayanan maya vektörleri ve genellikle tek başına bir genin işlevselliğini incelerken veya gen toksik olduğunda kullanılır. Ayrıca pirimidin nükleotidlerinin (T, C) biyosenteziyle ilgili bir enzimi kodlayan URA3 geniyle de bağlantılıdır;
- Bir replikasyon orijini içeren bir kromozomal DNA dizisini taşıyan Maya Replikatif Plazmidi (YRp). Bu plazmidler tomurcuklanma sırasında kaybolabildikleri için daha az kararlıdır. ⓘ
Plazmid DNA ekstraksiyonu
Plazmidler genellikle belirli bir diziyi saflaştırmak için kullanılır, çünkü genomun geri kalanından kolayca saflaştırılabilirler. Vektör olarak kullanımları ve moleküler klonlama için plazmidlerin genellikle izole edilmesi gerekir. ⓘ
Plazmid DNA'yı bakterilerden izole etmek için miniprepten maxiprep veya bulkprep'e kadar değişen çeşitli yöntemler vardır. İlki, plazmidin birkaç bakteri klonundan herhangi birinde doğru olup olmadığını hızlı bir şekilde bulmak için kullanılabilir. Verim, kısıtlama sindirimi ile analiz ve bazı klonlama teknikleri için yeterli olan az miktarda saf olmayan plazmid DNA'dır. ⓘ
İkincisinde, bir maxi-prep'in gerçekleştirilebileceği çok daha büyük hacimlerde bakteri süspansiyonu yetiştirilir. Özünde, bu ölçeklendirilmiş bir miniprep ve ardından ek saflaştırmadır. Bu, nispeten büyük miktarlarda (birkaç yüz mikrogram) çok saf plazmid DNA ile sonuçlanır. ⓘ
Çeşitli ölçeklerde, saflıkta ve otomasyon seviyelerinde plazmid ekstraksiyonu gerçekleştirmek için birçok ticari kit oluşturulmuştur. ⓘ
Konformasyonlar
Plazmid DNA, elektroforez sırasında bir jelde farklı hızlarda çalışan (belirli bir boyut için) beş konformasyondan birinde görünebilir. Konformasyonlar aşağıda elektroforetik hareketlilik (belirli bir uygulanan voltaj için hız) sırasına göre en yavaştan en hızlıya doğru listelenmiştir:
- Çentikli açık dairesel DNA'nın bir ipliği kesilmiştir.
- Gevşemiş dairesel DNA, her iki ipliği de kesilmemiş halde tamamen sağlamdır ancak enzimatik olarak gevşetilmiştir (süper sarmallar çıkarılmıştır). Bu, bükülmüş bir uzatma kablosunun gevşemesine ve rahatlamasına izin verip ardından kendi içine takılmasıyla modellenebilir.
- Doğrusal DNA'nın serbest uçları vardır, bunun nedeni her iki ipliğin de kesilmiş olması ya da DNA'nın in vivo doğrusal olmasıdır. Bu, kendi içine takılı olmayan bir elektrik uzatma kablosu ile modellenebilir.
- Süper sarmal (ya da kovalent olarak kapalı dairesel) DNA, her iki ipliği de kesilmemiş ve bütünleşik bir bükülme ile kompakt bir formla sonuçlanan tamamen sağlamdır. Bu, bir uzatma kablosunun bükülmesi ve ardından kendi içine takılmasıyla modellenebilir.
- Süper sarmal denatüre DNA, süper sarmal DNA gibidir, ancak onu biraz daha az kompakt hale getiren eşleşmemiş bölgelere sahiptir; bu, plazmid hazırlama sırasında aşırı alkaliniteden kaynaklanabilir. ⓘ
Küçük doğrusal parçalar için göç hızı, düşük voltajlarda uygulanan voltajla doğru orantılıdır. Daha yüksek voltajlarda, daha büyük parçalar sürekli artan ancak farklı oranlarda göç eder. Böylece, bir jelin çözünürlüğü artan voltajla azalır. ⓘ
Belirli, düşük bir voltajda, küçük doğrusal DNA parçalarının göç hızı uzunluklarının bir fonksiyonudur. Büyük doğrusal parçalar (20 kb'nin üzerinde) uzunluklarından bağımsız olarak belirli bir sabit hızda göç ederler. Bunun nedeni, moleküllerin 'solunum' yapması ve molekülün büyük kısmının jel matrisi boyunca öndeki ucu takip etmesidir. Saflaştırılmış plazmidleri analiz etmek için sıklıkla kısıtlama sindirimleri kullanılır. Bu enzimler DNA'yı belirli kısa dizilerde spesifik olarak parçalar. Ortaya çıkan doğrusal parçalar jel elektroforezinden sonra 'bantlar' oluşturur. Bantları jelden keserek ve DNA parçalarını serbest bırakmak için jeli çözerek belirli parçaları saflaştırmak mümkündür. ⓘ
Sıkı konformasyonu nedeniyle süper sarmal DNA, doğrusal veya açık dairesel DNA'ya göre jelden daha hızlı geçer. ⓘ
Biyoinformatik ve tasarım için yazılım
Plazmidlerin moleküler biyolojide bir teknik olarak kullanımı biyoinformatik yazılımı tarafından desteklenmektedir. Bu programlar plazmid vektörlerinin DNA dizisini kaydeder, restriksiyon enzimlerinin kesim bölgelerini tahmin etmeye ve manipülasyonları planlamaya yardımcı olur. Plazmid haritalarını işleyen yazılım paketlerine örnek olarak ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI ve WebDSV verilebilir. Bu yazılım parçaları, ıslak deneyler yapmadan önce tüm deneylerin silico'da yapılmasına yardımcı olur. ⓘ
Plazmid koleksiyonları
Yıllar içinde birçok plazmid üretilmiş ve araştırmacılar plazmidleri Addgene ve BCCM/LMBP gibi kar amacı gütmeyen kuruluşların plazmid veri tabanlarına vermişlerdir. Araştırma için bu veri tabanlarından plazmidler bulunabilir ve talep edilebilir. Araştırmacılar ayrıca sıklıkla plazmid dizilerini NCBI veritabanına yükler ve buradan belirli plazmidlerin dizileri alınabilir. ⓘ
Antibiyotik direnci
Çoğu plazmid içinde bulundukları bakteriye selektif avantaj sağlayan, bakteriyi bir antibiyotiğe dirençli yapmak gibi özellikler sağlayan genler veya gen grupları taşırlar. ⓘ
Her plazmid kromozomdan bağımsız olarak kopyalanmasını sağlayan, bir DNA dizinine sahiptir. Replikasyon orijini (İngilizce origin of replication) veya 'ori' olarak adlandırılan bu dizin DNA replikasyonunun başlama noktasıdır (şekil 2). Çoğu plazmid, Şekil 2'de gösterildiği gibi daireseldir ama ökaryotların kromozomlarına yüzeysel olarak benzeyen, doğrusal (lineer) plazmidlerde vardır. ⓘ