Denatürasyon
Proteinlerin veya nükleik asitlerin doğal ikincil ve/veya üçüncül ve/veya dördüncül yapılarının biyoaktivite kaybına yol açacak şekilde kısmen veya tamamen değiştirilmesi süreci.
Not 1: Ref'de verilen tanımdan değiştirilmiştir.
Not 2: Denatürasyon, proteinler ve nükleik asitler yüksek sıcaklığa veya aşırı pH değerlerine ya da fizyolojik olmayan tuz, organik çözücüler, üre veya diğer kimyasal madde konsantrasyonlarına maruz bırakıldığında meydana gelebilir.
Not 3: Bir enzim denatürize olduğunda katalitik aktivitesini kaybeder. ⓘ
Denatürasyon, proteinlerin veya nükleik asitlerin, güçlü bir asit veya baz, konsantre bir inorganik tuz, organik bir çözücü (örneğin alkol veya kloroform), çalkalama ve radyasyon veya ısı gibi bazı harici stres veya bileşiklerin uygulanmasıyla doğal hallerinde bulunan kuaterner yapı, tersiyer yapı ve sekonder yapıyı kaybettikleri bir süreçtir. Canlı bir hücredeki proteinler denatüre olursa, bu durum hücre aktivitesinin bozulmasına ve muhtemelen hücre ölümüne neden olur. Protein denatürasyonu aynı zamanda hücre ölümünün de bir sonucudur. Denatüre proteinler, hidrofobik grupların açığa çıkması nedeniyle konformasyonel değişim ve çözünürlük kaybından agregasyona kadar çok çeşitli özellikler sergileyebilir. Denatürasyonun bir sonucu olarak çözünürlük kaybına koagülasyon denir. Denatüre proteinler 3D yapılarını kaybederler ve bu nedenle işlev göremezler. ⓘ
Protein katlanması, bir globüler veya membran proteininin işini doğru yapıp yapamayacağının anahtarıdır; işlev görmesi için doğru şekilde katlanması gerekir. Bununla birlikte, katlanmada büyük rol oynayan hidrojen bağları oldukça zayıftır ve bu nedenle ısı, asitlik, değişen tuz konsantrasyonları ve proteini denatüre edebilecek diğer stres faktörlerinden kolayca etkilenir. Bu, homeostazın birçok yaşam formunda fizyolojik olarak gerekli olmasının bir nedenidir. ⓘ
Bu kavramın, insan tüketimine uygun olmaması için katkı maddeleriyle karıştırılmış alkol olan denatüre alkol ile ilgisi yoktur. ⓘ
Yaygın örnekler
Yiyecekler pişirildiğinde, bazı proteinleri denatüre olur. Haşlanmış yumurtanın sertleşmesinin ve pişmiş etin sertleşmesinin nedeni budur. ⓘ
Proteinlerin denatüre olmasının klasik bir örneği, tipik olarak büyük oranda su içindeki yumurta albüminlerinden oluşan yumurta akıdır. Yumurtadan yeni çıkmış yumurta akı şeffaf ve sıvıdır. Termal olarak dengesiz olan beyazların pişirilmesi onları opak hale getirerek birbirine bağlı katı bir kütle oluşturur. Aynı dönüşüm denatüre edici bir kimyasal ile de gerçekleştirilebilir. Yumurta aklarını bir aseton kabına dökmek de yumurta aklarını yarı saydam ve katı hale getirecektir. Kesilmiş sütün üzerinde oluşan deri, denatüre proteinin bir başka yaygın örneğidir. Ceviche olarak bilinen soğuk meze, çiğ balık ve kabuklu deniz ürünlerinin asidik bir narenciye turşusunda ısı olmadan kimyasal olarak "pişirilmesiyle" hazırlanır. ⓘ
Yumurta akının denatürasyonunun geri dönüşümsüz olmasına rağmen diğer birçok denatürasyon olayı geri dönüşümlüdür. ⓘ
Protein denatürasyonu
Denatüre proteinler, çözünürlük kaybından protein agregasyonuna kadar çok çeşitli özellikler sergileyebilir. ⓘ
1) Birincil yapı: polipeptit zincirindeki amino asitlerin doğrusal yapısı
2) İkincil yapı: bir alfa sarmal veya beta tabakasındaki peptit grubu zincirleri arasındaki hidrojen bağları
3) Tersiyer yapı: katlanmış alfa sarmalları ve beta sarmallarının üç boyutlu yapısı
4) Kuaterner yapı: çoklu polipeptitlerin üç boyutlu yapısı ve nasıl bir araya geldikleri ⓘ
1) Kuaterner yapı gösteren fonksiyonel protein
2) Isı uygulandığında proteinin molekül içi bağlarını değiştirir
3) Polipeptitlerin (amino asitler) açılımı ⓘ
Arka plan
Proteinler veya polipeptitler amino asit polimerleridir. Bir protein, gendeki kodonlar tarafından kodlanan RNA'yı "okuyan" ve çeviri olarak bilinen bir süreçte genetik talimattan gerekli amino asit kombinasyonunu bir araya getiren ribozomlar tarafından oluşturulur. Yeni oluşturulan protein ipliği daha sonra bakır, çinko veya demir gibi ek atomların veya moleküllerin eklendiği posttranslasyonel modifikasyona uğrar. Bu post-translasyonel modifikasyon süreci tamamlandıktan sonra, protein katlanmaya başlar (bazen kendiliğinden bazen de enzimatik yardımla), böylece proteinin hidrofobik elemanları yapının derinliklerine gömülür ve hidrofilik elemanlar dışarıda kalır. Bir proteinin son şekli, çevresiyle nasıl etkileşime gireceğini belirler. ⓘ
Protein katlanması, bir protein içindeki önemli miktarda zayıf molekül içi etkileşimler (Hidrofobik, elektrostatik ve Van Der Waals Etkileşimleri) ile protein-çözücü etkileşimleri arasındaki dengeden oluşur. Sonuç olarak, bu süreç büyük ölçüde proteinin içinde bulunduğu çevresel duruma bağlıdır. Bu çevresel koşullar sıcaklık, tuzluluk, basınç ve ilgili çözücüleri içerir ve bunlarla sınırlı değildir. Sonuç olarak, aşırı streslere maruz kalma (örneğin ısı veya radyasyon, yüksek inorganik tuz konsantrasyonları, güçlü asitler ve bazlar) bir proteinin etkileşimini bozabilir ve kaçınılmaz olarak denatürasyona yol açabilir. ⓘ
Bir protein denatüre edildiğinde, ikincil ve üçüncül yapılar değişir ancak amino asitler arasındaki birincil yapının peptit bağları bozulmadan kalır. Proteinin tüm yapısal seviyeleri işlevini belirlediğinden, protein denatüre edildikten sonra artık işlevini yerine getiremez. Bu, doğal hallerinde katlanmamış olan, ancak yine de işlevsel olarak aktif olan ve biyolojik hedeflerine bağlandıktan sonra katlanma eğiliminde olan, içsel olarak yapılandırılmamış proteinlerin aksine bir durumdur. ⓘ
Protein yapısı seviyelerinde denatürasyon nasıl gerçekleşir?
- Kuaterner yapı denatürasyonunda, protein alt birimleri ayrılır ve/veya protein alt birimlerinin uzamsal düzeni bozulur.
- Tersiyer yapı denatürasyonu aşağıdakilerin bozulmasını içerir:
- Amino asit yan zincirleri arasındaki kovalent etkileşimler (sistein grupları arasındaki disülfit köprüleri gibi)
- Polar amino asit yan zincirleri (ve çevresindeki çözücü) arasındaki kovalent olmayan dipol-dipol etkileşimleri
- Polar olmayan amino asit yan zincirleri arasındaki Van der Waals (indüklenmiş dipol) etkileşimleri.
- İkincil yapı denatürasyonunda, proteinler alfa-helisler ve beta-katlı tabakalar gibi tüm düzenli tekrarlama modellerini kaybeder ve rastgele bir bobin konfigürasyonu benimser.
- Kovalent peptit bağları ile bir arada tutulan amino asit dizisi gibi birincil yapı, denatürasyon ile bozulmaz. ⓘ
İşlev kaybı
Çoğu biyolojik substrat denatüre edildiğinde biyolojik işlevini kaybeder. Örneğin, substratlar artık aktif bölgeye bağlanamadığından ve substratların geçiş durumlarını stabilize etmekle görevli amino asit kalıntıları artık bunu yapabilecek şekilde konumlanmadığından enzimler aktivitelerini kaybeder. Denatüre etme süreci ve buna bağlı aktivite kaybı çift polarizasyonlu interferometri, CD, QCM-D ve MP-SPR gibi teknikler kullanılarak ölçülebilir. ⓘ
Ağır metaller ve metaloidler nedeniyle aktivite kaybı
Ağır metallerin proteinleri hedef alarak, proteinler tarafından yürütülen işlev ve aktiviteyi bozduğu bilinmektedir. Ağır metallerin geçiş metallerinin yanı sıra belirli miktarda metaloidden oluşan kategorilere ayrıldığını belirtmek önemlidir. Bu metaller, doğal, katlanmış proteinlerle etkileşime girdiğinde, biyolojik aktivitelerini engellemede rol oynama eğilimindedir. Bu engelleme farklı şekillerde gerçekleştirilebilir. Bu ağır metaller, bir proteinde bulunan fonksiyonel yan zincir gruplarıyla bir kompleks oluşturabilir veya serbest tiyollere bağlar oluşturabilir. Ağır metaller ayrıca proteinde bulunan amino asit yan zincirlerinin oksitlenmesinde de rol oynar. Bununla birlikte, metaloproteinlerle etkileşime girdiğinde, ağır metaller anahtar metal iyonlarının yerini alabilir ve değiştirebilir. Sonuç olarak, ağır metaller katlanmış proteinlere müdahale edebilir, bu da protein stabilitesini ve aktivitesini güçlü bir şekilde engelleyebilir. ⓘ
Tersinirlik ve tersinmezlik
Birçok durumda, denatürasyon geri dönüşümlüdür (denatürasyon etkisi ortadan kaldırıldığında proteinler doğal hallerine geri dönebilir). Bu süreç renatürasyon olarak adlandırılabilir. Bu anlayış, proteinlerin doğal hallerini almaları için gereken tüm bilgilerin proteinin birincil yapısında ve dolayısıyla proteini kodlayan DNA'da kodlandığı düşüncesine yol açmıştır, buna "Anfinsen'in termodinamik hipotezi" denir. ⓘ
Denatürasyon aynı zamanda geri döndürülemez de olabilir. Bu tersinmezlik tipik olarak termodinamik değil kinetik bir tersinmezliktir, çünkü katlanmış bir protein genellikle katlanmamış halinden daha düşük serbest enerjiye sahiptir. Kinetik tersinmezlik sayesinde, proteinin yerel bir minimumda sıkışmış olması, geri dönüşü olmayan bir şekilde denatüre edildikten sonra yeniden katlanmasını engelleyebilir. ⓘ
pH'a bağlı protein denatürasyonu
Denatürasyona, amino asitlerin ve kalıntılarının kimyasını etkileyebilen pH'daki değişiklikler de neden olabilir. Amino asitlerdeki iyonize olabilen gruplar, pH'da değişiklikler meydana geldiğinde iyonize olabilirler. Daha asidik veya daha bazik koşullara doğru bir pH değişikliği katlanmayı tetikleyebilir. Asit kaynaklı açılma genellikle pH 2 ile 5 arasında gerçekleşir, baz kaynaklı açılma ise genellikle pH 10 veya daha yüksek olmasını gerektirir. ⓘ
Nükleik asit denatürasyonu
Nükleik asitler (RNA ve DNA dahil), transkripsiyon veya DNA replikasyonu sırasında polimeraz enzimleri tarafından sentezlenen nükleotid polimerleridir. Omurganın 5'-3' sentezini takiben, tek tek azotlu bazlar hidrojen bağı yoluyla birbirleriyle etkileşime girebilir ve böylece daha yüksek dereceli yapıların oluşmasına izin verir. Nükleik asit denatürasyonu, nükleotidler arasındaki hidrojen bağı bozulduğunda meydana gelir ve önceden tavlanmış ipliklerin ayrılmasıyla sonuçlanır. Örneğin, yüksek sıcaklıklar nedeniyle DNA'nın denatürasyonu, Watson ve Crick baz çiftlerinin bozulmasına ve çift sarmallı sarmalın iki tek sarmala ayrılmasına neden olur. Nükleik asit iplikleri "normal" koşullara dönüldüğünde yeniden birleşebilir, ancak eski haline dönme çok hızlı gerçekleşirse, nükleik asit iplikleri kusurlu bir şekilde yeniden birleşebilir ve bu da bazların yanlış eşleşmesine neden olur. ⓘ
Biyolojik olarak indüklenen denatürasyon
DNA'daki antiparalel iplikler arasındaki kovalent olmayan etkileşimler, DNA replikasyonu, transkripsiyon, DNA onarımı veya protein bağlanması gibi biyolojik olarak önemli mekanizmalar gerçekleşmeye ayarlandığında çift sarmalı "açmak" için kırılabilir. Kısmen ayrılmış DNA alanı denatürasyon kabarcığı olarak bilinir ve daha spesifik olarak baz çiftlerinin koordineli ayrılması yoluyla bir DNA çift sarmalının açılması olarak tanımlanabilir. ⓘ
Denatürasyon kabarcığının termodinamiğini tanımlamaya çalışan ilk model 1966 yılında ortaya atılmış ve Poland-Scheraga Modeli olarak adlandırılmıştır. Bu model, DNA ipliklerinin denatürasyonunu sıcaklığın bir fonksiyonu olarak tanımlamaktadır. Sıcaklık arttıkça, Watson ve Crick baz çiftleri arasındaki hidrojen bağları giderek bozulur ve "denatüre döngüler" oluşmaya başlar. Bununla birlikte, Poland-Scheraga Modeli, DNA dizisi, kimyasal bileşim, sertlik ve burulmanın kafa karıştırıcı etkilerini hesaba katmadığı için artık temel olarak kabul edilmektedir. ⓘ
Son termodinamik çalışmalar, tekil bir denatürasyon kabarcığının ömrünün 1 mikrosaniye ile 1 milisaniye arasında değiştiği sonucuna varmıştır. Bu bilgi, DNA replikasyonu ve transkripsiyonunun yerleşik zaman ölçeklerine dayanmaktadır. Şu anda, denatürasyon kabarcığının termodinamik detaylarını daha iyi aydınlatmak için biyofiziksel ve biyokimyasal araştırma çalışmaları yürütülmektedir. ⓘ
Kimyasal ajanlara bağlı denatürasyon
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA denatürasyonunun istendiği en popüler bağlamlar arasında yer aldığından, ısıtma en sık kullanılan denatürasyon yöntemidir. Isı ile denatürasyon dışında, nükleik asitler formamid, guanidin, sodyum salisilat, dimetil sülfoksit (DMSO), propilen glikol ve üre gibi çeşitli kimyasal ajanlar aracılığıyla denatürasyon sürecine girebilir. Bu kimyasal denatüre edici ajanlar, önceden var olan azotlu baz çiftleriyle hidrojen bağı donörleri ve alıcıları için rekabet ederek erime sıcaklığını (Tm) düşürür. Hatta bazı ajanlar oda sıcaklığında denatürasyona neden olabilir. Örneğin, alkali ajanların (örn. NaOH) pH'ı değiştirerek ve hidrojen bağına katkıda bulunan protonları uzaklaştırarak DNA'yı denatüre ettiği gösterilmiştir. Bu denatüranlar, nükleik asit şeklinin elektroforetik hareketlilikleri üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak için nükleik asitlerin denatürasyonunu teşvik eden Denatüre Edici Gradyan Jel Elektroforez jeli (DGGE) yapmak için kullanılmıştır. ⓘ
Alternatif olarak kimyasal denatürasyon
Formamid ile denatüre edilen nükleik asitlerin optik aktivitesi (ışığın emilmesi ve saçılması) ve hidrodinamik özellikleri (translasyonel difüzyon, sedimantasyon katsayıları ve rotasyonel korelasyon süreleri) ısı ile denatüre edilen nükleik asitlere benzerdir. Bu nedenle, istenen etkiye bağlı olarak, DNA'yı kimyasal olarak denatüre etmek, nükleik asitleri denatüre etmek için ısıyla indüklenen denatürasyona göre daha yumuşak bir prosedür sağlayabilir. Isıtma, farklı boncuk boyutlarında boncuk öğütme, prob sonikasyonu ve kimyasal denatürasyon gibi farklı denatürasyon yöntemlerini karşılaştıran çalışmalar, kimyasal denatürasyonun açıklanan diğer fiziksel denatürasyon yöntemlerine kıyasla daha hızlı denatürasyon sağlayabileceğini göstermektedir. Özellikle hızlı renatürasyonun istendiği durumlarda, kimyasal denatürasyon ajanları ısıtmaya ideal bir alternatif sağlayabilir. Örneğin, NaOH gibi alkalin ajanlarla denatüre edilen DNA iplikleri, fosfat tamponu eklenir eklenmez yeniden denatüre olur. ⓘ
Hava nedeniyle denatürasyon
Havadaki birincil gazlar olan nitrojen ve oksijen gibi küçük, elektronegatif moleküller, çevredeki moleküllerin hidrojen bağına katılma kabiliyetini önemli ölçüde etkiler. Bu moleküller, hidrojen bağı donörleri için çevredeki hidrojen bağı alıcılarıyla rekabet eder, bu nedenle "hidrojen bağı kırıcıları" olarak hareket eder ve ortamdaki çevredeki moleküller arasındaki etkileşimleri zayıflatır. DNA çift sarmallarındaki antiparelel iplikler, Watson ve Crick baz çiftleri arasındaki hidrojen bağı ile kovalent olmayan bir şekilde bağlanır; bu nedenle nitrojen ve oksijen, havaya maruz kaldığında DNA'nın bütünlüğünü zayıflatma potansiyelini korur. Sonuç olarak, havaya maruz kalan DNA iplikçiklerinin ayrılması için daha az kuvvet gerekir ve daha düşük erime sıcaklıklarına örnek teşkil eder. ⓘ
Uygulamalar
Birçok laboratuvar tekniği nükleik asit iplikçiklerinin ayrılma yeteneğine dayanır. Nükleik asit denatürasyonunun özelliklerinin anlaşılmasıyla aşağıdaki yöntemler oluşturulmuştur:
- PCR
- Güney blotu
- Kuzey lekesi
- DNA Dizileme ⓘ
Denatürantlar
Protein denatürantları
Asitler
Asidik protein denatürantları şunları içerir:
- Asetik asit
- Su içinde %12 trikloroasetik asit
- Sülfosalisilik asit ⓘ
Üsler
Bazlar denatürasyonda asitlere benzer şekilde çalışır. Bunlar şunları içerir:
- Sodyum bikarbonat ⓘ
Çözücüler
Çoğu organik çözücü denatürandır:
Çapraz bağlama reaktifleri
Proteinler için çapraz bağlayıcı maddeler şunları içerir:
- Formaldehit
- Glutaraldehit ⓘ
Kaotropik ajanlar
Kaotropik ajanlar şunları içerir:
Disülfit bağı indirgenleri
Disülfit bağını redüksiyon yoluyla parçalayan maddeler:
- 2-Merkaptoetanol (Kuaterner yapıyı bozar)
- Ditiyotreitol (DTT)
- TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin) ⓘ
İndirgeme yoluyla disülfit bağlarını kıran ajanlar şunları içerir:
- 2-Merkaptoetanol
- Dithiothreitol
- TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin) ⓘ
Kimyasal olarak reaktif maddeler
Hidrojen peroksit, elementel klor, hipokloröz asit (klorlu su), brom, bromlu su, iyot, nitrik ve oksitleyici asitler ve ozon gibi ajanlar sülfit/tiol, aktif aromatik halkalar (fenilalanin) gibi hassas parçalarla reaksiyona girerek proteine zarar verir ve onu kullanılamaz hale getirir. ⓘ
Diğer
- Mekanik çalkalama
- Pikrik asit
- Radyasyon
- Sıcaklık ⓘ
Nükleik asit denatürantları
Kimyasal
Asidik nükleik asit denatürantları şunları içerir:
- Asetik asit
- HCl
- Nitrik Asit
Temel nükleik asit denatürantları şunları içerir:
- NaOH
Diğer nükleik asit denatürantları şunları içerir: